Do projektu NANOBIO jsou zapojena tato pracoviště LF HK a FN HK:
Ústav preventivního lékařství, Ústav patologické fyziologie
Ústav preventivního lékařství (do roku 2020 Ústav hygieny a preventivního lékařství) se společně s Ústavem patologické fyziologie dlouhodobě věnuje hodnocení genotoxického potenciálu chemických a fyzikálních faktorů pro člověka (od roku 2004). Předmětem epidemiologických studií bylo hodnocení genotoxického rizika osob exponovaných vybraným chemickým i fyzikálním faktorům, vyskytujících se v pracovním a životním prostředí, včetně medicínských léčebných postupů (v menší míře pak in vitro hodnocení genotoxického potenciálu materiálů). Modifikovaná metodika analýzy chromozomálních aberací periferních lymfocytů byla za účelem komplexnějšího hodnocení zdravotního rizika sledovaných faktorů kombinována v rámci studií s dalšími biologickými ukazateli účinku/citlivosti (biochemické a imunologické parametry) a s biologickými ukazateli expozice (metabolické parametry).
V roce 2016 navázala Lékařská fakulta v Hradci Králové a Fakultní nemocnice v Hradci Králové spolupráci se School of Medicine and CRANN, Trinity College Dublin (Yuri Volkov, Adriele Prina-Mello). Irští kolegové mají rozsáhlé zkušenosti s hodnocením interakcí mezi ENMs a biologickými systémy.
Používané metody: genotoxické testy – Micronucles test, test chromozomálních aberací, comet assay (okrajově cytotoxické testy – WST-1, LDH, CyQUANT Cell Proliferation Assays)
Přístrojové vybavení: Multidetekční reader BioTek, model Synergy HTX S1LFTA; Mikroskop Optika, model B-383PLi, s kamerou Optika, model OPTIKAM PRO 5LT; Fluorescenční mikroskop Optika, model B-500TiFL, kamera k mikroskopu MetaSystems, model CoolCube1m, vyhodnocovací software MetaSystems COMET (Single Cell Gel Electrophoresis Assay); Inverzní mikroskop KERN, model OCM-161, s kamerou KERN, model ODC 832, 5,1 MP; Biohazard box Telstar, model BIO II Advance 6; Inkubátor se řízenou atmosférou Binder, model C170; Centrifuga Hettich, model Rotina 380R
Ústav lékařské biologie a genetiky
Ústav lékařské biologie a genetiky patří mezi průkopníky in vitro metod v České republice a od počátku osmdesátých let minulého století se systematicky věnuje testování toxicity různých materiálů používaných v medicíně i stomatologii, přičemž v minulosti bylo toto testování i předmětem jeho činnosti jako akreditované zkušební laboratoře (akreditace ČIA). Testování toxicity in vitro prostřednictvím etablovaných metodik i hlubšími molekulárními vhledy (studia zaměřená na buněčně-specifickou stresovou signalizaci včetně odhalování specifických toxikologických „endpoints“) pokračuje až do dnešní doby v rámci úspěšného řešení několika dlouhodobějších výzkumných záměrů a projektů.
Používané metody: cytotoxické testy – testy viability a metabolické aktivity (WST-1, LDH, NR, MTT, Trypan blue, Alamar blue), časosběrná video-mikroskopie, metody imunofluorescenční mikroskopie, Western blot, stanovení apoptózy, stanovení senescence, sledování buněčné migrace
Přístrojové vybavení: vysokokapacitní zobrazovací cytometr ImageXpress, zařízení pro časosběrnou videomikroskopii BioStation IM Nikon, přístroj pro kvantifikaci western blotů Azure, RT-PCR, spektrofotometr Tecan, přístroj pro dynamické sledování buněčné proliferace a migrace xCELLigence, fluorescenční mikroskopy Nikon a Olympus, laminární boxy, osmometr a další běžné laboratorní vybavení.
Ústav histologie a embryologie
Doménou výzkumných aktivit pracovní skupiny Ústavu histologie a embryologie je studium progenitorových a kmenových buněk včetně multipotentních tkáňově specifických kmenových buněk (např. neurální kmenové buňky, kmenové buňky zubní pulpy, kmenové buňky kostní dřeně) a pluripotentních kmenových buněk (ES a IPS buněk). Studium pokrývá izolaci a propagaci kmenových buněk in vitro, jejich charakteristiku (včetně kinetiky, imunofenotypizace a genové exprese), řízenou diferenciaci in vitro i funkční testy včetně transplantaci kmenových buněk zvířecím příjemcům s využitím modelu transgenních myší exprimujících zelený fluoreskující protein (GFP), ale též přípravu skafoldů pro tkáňové inženýrství. Součástí výzkumných aktivit je též sledování účasti kmenových buněk na regeneraci tkání, modulace těchto procesů a studium mikroprostředí kmenových buněk (niche) ve vybraných tkáních. V oblasti biologie kmenových buněk má Ústav histologie a embryologie řadu priorit – je například prvním pracovištěm ve střední Evropě, které zahájilo izolace a studium neurálních kmenových buněk (od roku 1995) a kmenových buněk zubní pulpy od roku 2003. V rámci histolopatologických analýz provádí ústav rozbory změn buněk a tkání vystavených účinku různých faktorů i látek včetně xenobiotik.
Používané metody: cytotoxické testy (LDH, WST-1), proliferační aktivita, změna diferenciačního potenciálu, imunocytochemie/histochemie, western blot, buněčná metabolická aktivita
Přístrojové vybavení: RT-PCR, spektrofotometr, XCelligence reader, průtokový cytometr, kryostat Leica CM1900, multifunkční mikrovlnný tkáňový procesor HistoSTATION Milestone, í invertovaný mikroskop Nikon ECLIPSE Ti s epifluorescencí a digitální kamerou DS-Qi, mikroskop Olympus BX51 s epifluorescencí a digitální kamerou DP71
Laboratoř transmisní elektronové mikroskopie (Ústav histologie a embryologie a Ústav lékařské biofyziky)
Vyšetření ultrastruktury buněk a tkání v transmisním elektronovém mikroskopu (TEM) se v laboratoři TEM provádí již od 60. let 20. století. Do současné doby zde byly klasickou metodou zpracování pro TEM (s použitím epoxydových pryskyřic) studovány mnohé tkáně a orgány v rámci základního i klinického výzkumu, např. nervová tkáň, slinné žlázy a kůže. Použití akrylátových pryskyřic pro zpracování biologického materiálu v laboratoři TEM umožnilo zavedení imunohistochemických detekcí různých antigenů na ultratenkých řezech tkání a orgánů, jejichž lokalizace v buňkách je identifikována pomocí nanočástic zlata.
V poslední době byla metoda TEM využívána pro studium diferenciačních procesů buněk, například v neurosférách tvořených neurálními kmenovými buňkami, pro studium apoptózy (buněčné smrti), pro studium indukce tvorby primárních řasinek, provázející reakci buněk na stresové podněty nebo pro studium role transplantovaných kmenových a progenitorových buněk, například z kostní dřeně, v procesu regenerace kosterní svaloviny nebo při osídlování tzv. „skafoldů“ připravených decelularizací kosterního svalu.
Používané metody: klasická transmisní elektronová mikroskopie (vyšetření ultrastruktury buněk a tkání), imunohistochemické detekce antigenů na ultratenkých řezech buněk a tkání vyšetřovaných v transmisním elektronovém mikroskopu (angl. immunogold electron microscopy)
Přístrojové vybavení: transmisní elektronový mikroskop JEOL JEM 1400Plus
Ústav klinické imunologie a alergologie, Ústav klinické biochemie a diagnostiky
Dlouhodobá výzkumná aktivita Ústavu klinické imunologie a alergologie (UKIA) a Ústavu klinické biochemie a diagnostiky (UKBD), které jsou společnými pracovišti Lékařské fakulty v Hradci Králové a Fakultní nemocnice v Hradci Králové, je zaměřená na obranný a poškozující zánět, jeho vznik, průběh a ukončení. Jedním ze sledovaných modelů zánětlivé odpovědi jsou kardiochirurgické operace. Jsou analyzovány jak prozánětové, tak protizánětové mediátory, které navíc mohou být odrazem klinického stavu a případných pooperčních komplikací pacientů. K analýze jsou odebírány krevní vzorky, ve kterých jsou kvantitativně stanovovány vybrané parametry. Ověřována je i funkční aktivita buněk, kdy je využíváno možnosti krátkodobé kultivace stimulovaných buněk.
Další oblastí výzkumu je (ve spolupráci s Ústavem patologické fyziologie, Ústavem preventivního lékařství LF HK a Klinikou nemocí kožních a pohlavních Fakultní nemocnice v Hradci Králové) studium zánětové odpovědi na modelu pacientů s psoriázou léčených Goeckermanovou terapií (polycyklické aromatické uhlovodíky a UV záření). V souvislosti s Goeckermanovou léčbou byla mapována variabilita lidského genomu týkající se biotransformace xenobiotik a jejich možný synergický efekt v I. a II. fázi metabolismu podávaného kamenouhelného dehtu. Genetické testy jsou prováděny metodou analýzy restrikčních fragmentů, použitím technologie real-time a nově též pomocí digitální PCR.
Parametry vrozené imunity v nejširších souvislostech studuje toto pracoviště i u modelu intraamniálního zánětu ve spolupráci s Porodnickou a gynekologickou klinikou FN Hradec Králové. Výzkum je dlouhodobě zaměřen na předčasný odtok plodové vody a predikci komplikací předčasného porodu. Analyzovány jsou vzorky plodové vody, pupečníkové krve i cervikálních a vaginálních tekutin. K výzkumu v těchto oblastech se využívají především imunochemické metody ELISA a luminexová esej. Součástí je také analýza pomocí průtokové cytometrie a proteomické metody.
Používané metody: Hodnocení produkce a bioaktivity pro/protizánětlivých cytokinů pomocí buněčných esejí – reportérové buněčné linie, testy cytotoxicity – LDH assay, imunochemické metody – ELISA, Luminexová esej, průtoková cytometrie, zaváděna je elektroforéza – western blot
Přístrojové vybavení: Multidetekční reader Synergy HTX S1LFTA + duální injektory (BioTek), chemiluminiscenční dokumentační zařízení pro WB Alliance Q9 Advanced (Uvitec), tyčový sonikátor Q700 (QSonica), LUMINEX Bio-plex 200 system (Bio Rad), optický inverzní mikroskop Eclipse Ts2 (Nikon), Průtokový cytometr Navios (Beckman Coulter), biohazard box třída II typ A2 MSC, Advantage (ThermoFisher Scientific), CO2 inkubátor s řízenou atmosférou CB 170 (Binder)